Práctica 6: TINCIÓN DE GRAM

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Fundamento
La tinción de Gram se desarrolla en tres fases:
1. Tinción con un colorante catiónico, que se una a la pared bacteriana y se estabilice con ayuda de un mordiente (lugol).
2. Decoloración con alcohol/acetona  que disuelva la membrana externa de las bacterias gramnegativas y no de las grampositivas, debido a su grosor y menor contenido lipídico.
3. Coloración de contraste que tiña la pared de las gramnegativas de rojo, y las grampositivas azules, con el primer colorante.

Objetivo
Identificar si la bacteria es grampositiva (azul) o gramnegativa (rojo).

Material y Reactivos
Safranina, cristal violeta, lugol, H2O, alcohol-acetona, portas, puente de tinción, bacterias 3 y 7, asa de siembra platino, suero fisiológico, mechero Bunsen y pipetas Pasteur.

Protocolo
1. Preparamos el material.
2. Esterilizamos el asa de siembra con la llama y enfriamos tocando en una zona donde no haya cultivo.
3. La muestra se toma de arriba abajo del tubo y extendemos el asa con la muestra y una gota de SSF en un porta.
4. Fijamos por calor la extensión, sin dejarlo mucho tiempo para que el porta no se rompa.
5. Cubrir la extensión con el colorante cristal violeta y lo dejamos 1 min.
6. Lavamos brevemente con agua del grifo y escurrimos.
7. Cubrir el porta con lugol (mordiente) y dejamos 1 min.
8. Lavamos con agua del grifo y escurrimos.
9. Cubrir el porta con alcohol/acetona 30s y escurrimos.
10. Lavar con agua del grifo y escurrir.
11. Cubrir la extensión con colorante safranina y dejamos 2 min.
12. Lavar abundantemente con agua del grifo y dejar secar.
13. Visualizar en el microscopio.
Bacterias grampositivas: bacilos y streptobacilos.












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